收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。

產品名稱

名稱    腎小管上皮細胞

2.組織來源：腎組織

3.產品規格：5×105cells/T25細胞培養瓶

4.細胞簡介：

人腎小管上皮細胞分離自腎組織；腎臟是機體的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內代謝產物及某些廢物、毒物，同時經重吸收功能保留水份及其他有用物質，如葡萄糖、蛋白質、氨基酸、鈉離子、鉀離子、碳酸氫鈉等，以調節水、電解質平衡及維護酸堿平衡。腎臟同時還有內分泌功能，生成腎素、促紅細胞生成素、活性D3、前列腺素、激肽等，又為機體部分內分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機體內環境的穩定，使新陳代謝得以正常進行。腎小管是機體腎臟器官上與腎小囊壁層相連的一條細長上皮性小管，具有重吸收（reabsorption）和排泌作用。腎小管按不同的形態結構、分布位置和功能分成近端小管、髓袢和遠端小管三部分；近端小管可分為直部和曲部，曲部也稱為近曲小管，位于皮質迷路內，于腎小體附近高度蟠曲；遠端小管曲部也稱為遠曲小管，位于皮質迷路內。腎小管上皮細胞是腎小管外面的一層細胞，腎小管上皮細胞的分離、培養是研究腎臟疾病的一項重要技術，目前該細胞分離方法有酶分離法、化學分離法篩網分離法、顯微解剖分離法、流式細胞儀分離法等。腎小管上皮細胞主要功能：①腎小管上皮細胞重吸收原尿中幾乎全部的葡萄糖和氨基酸；②排泌非營養物質進入終尿；③細胞能分泌炎癥介質如細胞因子和趨化因子，通過產生IL-8或直接趨化白細胞參與急性炎癥反應；④移植腎炎癥和新月體腎炎中PTEpiC表達IL-2R和MHC-Ⅱ類抗原，這說明腎小管上皮細胞參與腎免疫損傷的發生。隨著對腎間質纖維化機制研究的日漸加深，腎小管上皮細胞（RTECs）在其中的作用日益被人們重視。因此，提供良好的腎小管上皮細胞模型，在腎小管間質疾病的發病機制和治療藥物篩選的研究中是非常重要的。

5.方法簡介：

實驗室分離的人腎小管上皮細胞 采用膠原酶消化結合差速貼壁法制備而來制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質量檢測：

實驗室分離的人腎小管上皮細胞 經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養信息：

包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產品貨號CM-H193

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態上皮細胞樣

傳代特性可傳1-2代左右

消化液0.25%胰蛋白酶

培養條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。